Editjat minn Peter Sarnow, l-Iskola tal-Mediċina tal-Università ta’ Stanford, l-Università ta’ Stanford, California, approvat fil-25 ta’ Diċembru 2020 (rivedut fil-25 ta’ Ottubru 2020)
Nirrapportaw l-interazzjoni bejn is-subunitajiet fir-replikazzjoni ta 'koronavirus-traskrizzjoni kumplessi, li huma essenzjali għar-replikazzjoni u l-konservazzjoni evoluzzjonarja.Aħna pprovdejna evidenza li d-dominju NiRAN assoċjat ma 'nsp12 għandu attività transferase ta' nucleoside monophosphate (NMP) f'trans, u identifikajna nsp9 (proteina li torbot RNA) bħala l-mira tagħha.NiRAN jikkatalizza t-twaħħil kovalenti tal-parti NMP mat-terminal amino kkonservat nsp9 f'reazzjoni li tiddependi fuq jonji Mn2 + u residwi Asn konservati adjaċenti.Instab li l-attività NiRAN u nsp9 NMPylation huma essenzjali għar-replikazzjoni tal-koronavirus.Id-dejta tippermettilna li torbot din l-attività tal-markatur tal-enzima tal-virus nested mal-osservazzjonijiet preċedenti fl-ipoteżi li l-bidu tas-sinteżi tal-RNA fi klassi ta 'viruses tal-RNA huwa konsistenti funzjonalment u evoluzzjonarjament.
L-RNA polimerażi dipendenti fuq l-RNA (RdRps) ta’ Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, u 12-il familja oħra) hija marbuta mad-dominju amino-terminal (N-terminal) fil-proteina mhux strutturali (nsp) rilaxxata mill-poliproteina, imsejħa NiRAN 1ab huwa magħmul minn protease prinċipali virali (Mpro).Preċedentement, l-attività GMPylation/UMPylation tal-virus arterjali NiRAN-RdRp nsp stess kienet irrappurtata, u ġie ssuġġerit li jiġi ġġenerat temporanju għat-trasferiment ta 'nukleoside monophosphate (NMP) għall- (bħalissa mhux magħruf) virus u/jew ċelluli bijopolimerizzazzjoni Things.Hawnhekk, aħna nuru li l-koronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E u Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) għandu attività NMPylation dipendenti fuq Mn2+, li hija derivata minn nsp9 permezz tal-formazzjoni ta’ nsp9 medjat minn Mpro Wara l-nsps tal-ġenb N-terminal huwa rilaxxat proteolitikament, il-fosforamidat huwa marbut mal-amina primarja (N3825) fl-N-terminal ta 'nsp9.Uridine triphosphate huwa n-nukleotide preferut f'din ir-reazzjoni, iżda adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, u cytidine triphosphate huma wkoll ko-sottostrati adattati.Studji ta 'mutazzjoni li jużaw proteini nsp9 u nsp12 tal-koronavirus rikombinanti u mutanti HCoV-229E ta' inġinerija ġenetika ddeterminaw ir-residwi meħtieġa għal nsp9 NMPylation medjat minn NiRAN u replikazzjoni tal-virus fil-kultura taċ-ċelluli.Id-dejta kkonfermat it-tbassir tar-residwi tas-sit attiv NiRAN u ddeterminat ir-rwol importanti tar-residwi nsp9 N3826 f'nsp9 NMPylation u r-replikazzjoni tal-virus in vitro.Dan il-fdal huwa parti mis-sekwenza tal-tripeptide N-terminal NNE kkonservata u wera li huwa l-uniku residwu invarjanti ta 'nsp9 u l-omologi tiegħu fil-familja tal-koronavirus.Dan l-istudju jipprovdi pedament sod għall-istudju funzjonali tal-attività ta 'NMPylation ta' viruses oħra nested u jipproponi miri possibbli għall-iżvilupp ta 'mediċini antivirali.
Nidovirales positive-stranded RNA virus jinfetta varjetà ta 'vertebrati u invertebrati (1, 2).L-ordni bħalissa tinkludi 14-il familja (3), li minnhom il-familja tal-Coronavirus ġiet studjata b'mod estensiv fl-aħħar 20 sena.F'dak iż-żmien, tliet koronavirus żoonotiċi ħarġu minn ospitanti ta 'annimali u kkawżaw tifqigħat fuq skala kbira ta' infezzjonijiet respiratorji severi fil-bnedmin.Inklużi pandemiji persistenti kkawżati minn mard infettiv akut sever.Sindromu Respiratorju Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).In-nidoviruses jaqsmu organizzazzjoni komuni tal-ġenoma, u s-subunità tal-kumpless ta' replikazzjoni-traskrizzjoni marbuta mal-membrana (RTC) hija kkodifikata fiż-żewġ terzi 5-?²-terminal u s-subunità strutturali prinċipali tal-partiċella tal-virus, kif ukoll xi aċċessorji .Proteina, kodifikata fit-terz tat-tarf 3??² tal-ġenoma (1).Ħlief għal familja waħda ta 'viruses planarian (Monoviridae) (8), il-viruses kollha nested jikkodifikaw subunitajiet RTC f'żewġ frejms kbar ta' qari miftuħa (ORF) ORF1a u ORF1b, li huma tradotti minn RNA ġenomika ta '.ORF1a jikkodifika polyprotein (pp) 1a, u ORF1a u ORF1b jikkodifikaw b'mod konġunt pp1ab.Bil-parteċipazzjoni ġenerali tal-protease prinċipali (Mpro) kodifikata minn ORF1a, kemm pp1a kif ukoll pp1ab huma pproċessati proteolitikament f'varjetà ta 'proteini mhux strutturali (nsps), magħrufa wkoll bħala 3CLpro, minħabba li għandha omoloġija mat-3Cpro tal-picornavirus ( 9).Dawn nsps huma maħsuba li jiġu mmuntati f'RTC dinamiku kbir, jikkatalizzaw is-sinteżi ta 'RNA ġenomika (replikazzjoni) u sett ta' RNA subgenomic (traskrizzjoni), u huma wżati biex jikkoordinaw l-espressjoni tal-ORF li jinsab 'l isfel minn ORF1b (10?? ?12).
L-RTC ewlieni jinkludi RNA polymerase dipendenti fuq l-RNA (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) u diversi enzimi ta’ pproċessar ta’ RNA, li huma prinċipalment kodifikati f’ORF1b u fil-familja tal-koronavirus Fih nsp12-nsp16 u nsp9-nsp12 fil-familja Arterioviridae (ara referenza 10ââ 12).RdRp u HEL1 jirrappreżentaw żewġ (wieħed minn ħamsa) oqsma kkonservati tal-virus tal-bejta tal-għasafar u għandhom omoloġija fost viruses RNA oħra.Core replicase huwa maħsub li huwa megħjun minn subunitajiet oħra, inklużi diversi nsps żgħar rilaxxati mir-reġjun carboxy-terminal (C-terminal) ta 'pp1a, 'l isfel minn Mpro (coronavirus nsp5 u virus arterjali nsp4, rispettivament).Għandhom protezzjoni limitata speċifika għall-familja u attivitajiet diversi (reveduti f'referenza 10ââ12).
Relattivament reċentement, dominju b'karatteristiċi uniku motif sekwenza instab fil-terminal amino (N-terminal) maġenb RdRp fil-viruses kollha nested, iżda l-ebda viruses RNA oħra (16).Ibbażat fuq il-post u l-attività tan-nukleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), dan id-dominju jismu NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Il-kombinazzjoni ta 'dominju doppju ta' NiRAN-RdRp tikkostitwixxi nsp12 fil-familja Coronaviridae u nsp9 fil-familja Arterioviridae, u f'nestoviridae oħra, NiRAN-RdRp huwa mistenni li jiġi rilaxxat bħala nsp indipendenti mill-poliproteina virali.Fil-koronavirus, id-dominju NiRAN fih ??1/450 residwi u huwa konness mad-dominju C-terminal RdRp permezz tar-reġjun tal-linker (16?19).F'Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), nsp9 rikombinanti juri attivitajiet ta 'UMPylation (awto) li jiddependu mill-jone Mn2+ u GMPylation, li jiddependu fuq tliet bażijiet ta' sekwenza kkonservata f'nestovirus, AN, BN u CN Ir-residwi fis-sekwenza.Fejn N tirrappreżenta NiRAN) (16).Il-ġenb N-terminal ta 'dawn il-motifi huwa motif inqas konservattiv preAN.Xi wħud minn dawn ir-residwi huma kkonservati wkoll f'kinażi ta' proteini relatati mill-bogħod, fejn intwerew li huma involuti fl-irbit tan-nukleoside triphosphate (NTP) u fl-attività katalitika (20, 21).B'mod konsistenti ma 'din l-osservazzjoni, bosta residwi tas-sit attivi ewlenin fil-psewdokinase SelO minn Pseudomonas syringae jistgħu jiġu mmuntati mas-superkumpless SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ippubblikat reċentement.Residwi NiRAN tal-Coronavirus ikkonservati sovraposti fil-mikrostruttura tal-elettroni.Proteina rikombinanti (17).Huwa spekulat li l-u/GMPylation dokumentat (awto) jipproduċi stat temporanju biex jittrasferixxi NMP għas-sottostrat (bħalissa mhux magħruf) (16), u x-xebh strutturali bejn NiRAN u protein kinase (17, 19) ) Hija l-ipoteżi li NiRAN jimmodifika proteini oħra.
Ħafna karatteristiċi, inkluża l-assoċjazzjoni sistematika unika u unika tagħha ma 'viruses nested u separazzjoni ġenetika minn RdRp, jagħmlu NiRAN enzima regolatorja ewlenija raġonevoli għal viruses nested, li hija kritika għall-emerġenza u l-identità tagħhom.Preċedentement, ġew imsejħa tliet funzjonijiet possibbli li jinvolvu NiRAN biex jirregolaw it-traduzzjoni tal-ġenoma/subġenomika jew ir-replikazzjoni/traskrizzjoni.Meta titqies id-dejta skarsa u mhux kompluta disponibbli f'dak iż-żmien, kull funzjoni għandha l-vantaġġi u l-iżvantaġġi tagħha (16).F'din ir-riċerka, aħna nimmiraw li ngħaqqdu l-istudji bijokimiċi u ġenetiċi inversi tal-koronavirus li jirrappreżentaw iż-żewġ ġeneri, u npoġġu s-sejbiet tagħna fl-isfond evoluzzjonarju tal-mutazzjoni naturali tal-familja tal-koronavirus, sabiex niksbu għarfien dwar dan l-isfera Misterjuża.Nirrapportaw avvanzi kbar fil-fehim ta 'NiRAN permezz ta' l-identifikazzjoni ta 'miri naturali fl-RTC, li (fost it-tliet ipoteżi disponibbli) tikkontribwixxi għar-rwol ta' dan id-dominju fil-bidu tas-sintesi ta 'RNA tal-virus nested.Din ir-riċerka tiftaħ ukoll possibbiltajiet għal rwoli oħra ta 'NiRAN fuq l-interface host tal-virus.
Sabiex nikkaratterizzaw il-proprjetajiet enżimatiċi tad-dominju NiRAN relatat mal-virus corona nsp12, ipproduċejna forma rikombinanti tal-koronavirus uman 229E (HCoV-229E) nsp12 f'E. coli, b'tikketta His6 fit-terminal C, u għaqqadna l- proteina bi [α32-P ] Inkuba flimkien ma 'NTP fil-preżenza ta' MnCl2 kif deskritt f'Materjali u Metodi.L-analiżi tal-prodott tar-reazzjoni indikat il-preżenza ta 'proteina radjutikkettata li tikkomigra ma' nsp12 (106 kDa), li tindika li l-coronavirus nsp12 jikkatalizza l-formazzjoni ta 'adducts proteina-NMP kovalenti, iffurmati preferenzjali b'uridine monophosphate (UMP) (Figura 1A) U B).L-analiżi kwantitattiva wriet li meta mqabbla ma 'nukleotidi oħra, l-intensità tas-sinjal tal-inkorporazzjoni tal-UMP żdiedet minn 2 sa 3 darbiet (Figura 1C).Din id-dejta hija konsistenti mal-attività NMP transferase prevista tad-dominju NiRAN tal-koronavirus (16), iżda tindika li l-preferenzi tan-nukleotidi tad-dominju NiRAN tal-koronavirus u l-virus arterjali huma differenti.
Attività ta 'awto-NMPylation ta' HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ġie inkubat bl-NTP nominat [α-32P] fil-preżenza ta '6 mM MnCl2 għal 30 minuta (ara Materjali u Metodi għad-dettalji).Il-prodotti tar-reazzjoni ġew separati b'SDS-PAGE u mtebbgħin bil-blu brillanti Coomassie.(B) Il-proteina radjutikkettata hija viżwalizzata b'immaġini tal-fosfru.Il-pożizzjonijiet ta 'nsp12-His6 u markaturi tal-massa molekulari tal-proteini (f'kilodaltons) huma murija f'A u B. (C) L-intensità tas-sinjal radjuattiv (medja ± SEM) ġiet iddeterminata minn tliet esperimenti indipendenti.*P≤0.05.Is-saħħa tas-sinjal (perċentwali) hija relatata mal-UTP.
Għalkemm l-attivitajiet ta' enzimi relatati ma' NiRAN intwerew li huma essenzjali għar-replikazzjoni ta' EAV u SARS-CoV fil-kultura taċ-ċelluli (16), il-funzjoni speċifika ta' NiRAN u l-miri potenzjali għadhom ma ġewx determinati.Ix-xebh strutturali rrappurtat reċentement bejn NiRAN u familja ta 'proteini b'tinja li jixbħu proteina kinażi (17, 22) wassalna biex nittestjaw l-ipoteżi li NiRAN jikkatalizza l-NMPylation ta' proteini oħra.Aħna ġġenerajna sett ta 'miri omologi potenzjali, inklużi proteini mhux strutturali kodifikati minn HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), li kull wieħed ikun fih tikketta His6 C-terminal (appendiċi SI, Tabella S1), U inkuba dawn il-proteini bi [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) fil-preżenza jew in-nuqqas ta' nsp12.L-albumina tas-serum bovin u l-proteina tal-fużjoni MBP-LacZα prodotta f'E. coli servew bħala kontrolli (Figura 2A, korsiji 1 sa 7).Il-proteina radjutikkettata ġiet analizzata b'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) u awtoradjografija, u nstab li kien hemm sinjal radjuattiv qawwi fir-reazzjoni li fiha nsp12 u nsp9.Il-pożizzjoni tas-sinjal tikkorrispondi għall-massa molekulari ta 'nsp9, li tindika UMPylation medjata minn nsp12 ta' nsp9 (Figura 2B, binarju 7).L-ebda proteini oħra tat-test ma nstabu li huma UMPylated, li wassalna biex nikkonkludu li nsp9 huwa substrat speċifiku ta 'nsp12.Konsistenti mad-dejta ta 'awto-NMPylation murija fil-Figura 1, nsp12 huwa kapaċi jittrasferixxi l-erba' NMPs kollha għal nsp9, għalkemm l-effiċjenza hija differenti, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Stampa).3 A u B).Taħt il-kundizzjonijiet użati f'dan l-assaġġ (tqassar il-ħin ta 'reazzjoni u espożizzjoni, tnaqqas il-konċentrazzjoni ta' nsp12; materjali u metodi), l-awto-NMPylation ta 'nsp12 ma setgħetx tiġi skoperta (qabbel Figura 2B, korsija 7, u Figura 1B), li wera effettiva (U rawnds multipli) UMP mċaqalqa minn nsp12 għal nsp9.L-attività tat-trasferimentażi UMP teħtieġ il-preżenza ta 'jonji Mn2 +, kif muri fil-Figura 3C, filwaqt li attività ta' transferase UMP minima biss kienet osservata fil-preżenza ta 'Mg2 +, u l-ebda attività fil-preżenza taż-żewġ katjoni divalenti l-oħra ttestjati.Dejta simili nkisbet f'assaġġi NMPylation li fihom cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), u adenosine triphosphate (ATP) (appendiċi SI, Figura S1).
HCoV-229E UMPylation medjat minn nsp12 ta 'nsp9.Serje ta’ sottostrati ta’ proteini (inkluż albumina tas-serum bovin, MBP-lacZα, u serje ta’ nsps HCoV-229E ttikkettjati b’C-terminal His6 kodifikat minn ORF1a) intużaw biex jevalwaw l-attività UMPylation ta’ HCoV-229E nsp12-His6⁺ medjata. proteina.Inkuba l-proteina bi [α-32P] UTP għal 10 minuti fin-nuqqas (A) jew il-preżenza (B) ta' nsp12 kif deskritt fil-materjali u l-metodi.Fil-parti ta 'fuq ta' A u B, jidher ġel SDS-polyacrylamide imtebba b'Coomassie Brilliant Blue, u fil-qiegħ ta 'A u B, jintwerew l-awtoradjogrammi korrispondenti.Il-pożizzjoni tal-markatur tal-massa molekulari tal-proteina (f'kilodaltons) tingħata fuq ix-xellug.Il-pożizzjoni ta 'nsp12-His6 (B, fuq) u s-sinjal radjuattiv osservat waqt l-inkubazzjoni ta' nsp12-His6 b'nsp9-His6 (B, korsija 7) huma indikati wkoll, li jindika li [α-32P] UMP għal nsp9-His6 (12.9 kDa), li ma kienx osservat għal proteini oħra ttestjati.
HCoV-229E Karatterizzazzjoni bijokimika u viroloġika medjata minn NiRAN ta 'nsp9 NMPylation.(A u B) Ir-rwol tal-ko-substrat tan-nukleotide użat fir-reazzjoni.Nsp12-His6 u nsp9-His6 huma mħallta u inkubati fil-preżenza ta '[α-32P] NTPs differenti fl-assaġġ NMPylation standard.(A, fuq) nsp9-His6 imtebba b'Coomassie separati minn SDS-PAGE.(A, qiegħ) Awtoradjografu tal-istess żona tal-ġel.(B) L-attività relattiva (medja ± SEM) fil-preżenza tal-kofattur tan-nukleotide indikat hija ddeterminata minn tliet esperimenti indipendenti.*P≤0.05.(C) Ir-rwol tal-joni tal-metall.Jintwera t-test standard ta 'NMPylation fil-preżenza ta' [α-32P] UTP u joni differenti tal-metall, kull wieħed b'konċentrazzjoni ta '1 mM.F'Ċ, in-naħa ta 'fuq, tintwera nsp9-His6 imtebba' Coomassie, u f'Ċ, fil-qiegħ, tidher l-awtoradjografija korrispondenti.Id-daqs tal-proteina ttikkettjata (f'kilodaltons) huwa muri fuq ix-xellug ta 'A u C. (D) Il-forma mutanti ta' HCoV-229E nsp12-His6 li ġġorr is-sostituzzjoni speċifikata ta 'aċidu amminiku hija fi [α-32P]UTP, kif deskritt f'Materjali u Metodi.L-nsp9-His6 radjutikkettat prodott fir-reazzjoni ta 'NMPylation jiġi skopert permezz ta' immaġni ta 'fosforilazzjoni (D, fuq).L-attività relattiva meta mqabbla mal-proteina tat-tip selvaġġ (wt) hija murija f'D, u l-qiegħ jittieħed bħala l-medja (± SEM) minn tliet esperimenti Indipendenti.L-asterisks jindikaw sostituzzjonijiet ta' residwi mhux ikkonservati.(E) It-titer tal-virus fis-supernatant tal-kultura taċ-ċelluli p1 miksub 24 siegħa wara l-infezzjoni kien iddeterminat b'assaġġ tal-plakka.Is-sostituzzjonijiet tal-kodon fid-dominju NiRAN tal-mutant HCoV-229E maħdum huma indikati (in-numerazzjoni tar-residwi hija bbażata fuq il-pożizzjoni tagħhom f'pp1ab).Il-mutant tas-sit attiv RdRp defiċjenti fir-replikazzjoni nsp12_DD4823/4AA intuża bħala kontroll.
Sabiex niksbu għarfien aktar profond tas-sit attiv ta 'NiRAN u niddeterminaw ir-residwi relatati mal-attività ta' NMP transferase speċifika għal nsp9, għamilna analiżi tal-mutazzjoni, li fiha ssostitwijna r-residwi konservattivi fil-motifi NiRAN AN, BN u CN ( 16) Huwa Ala (appendiċi SI, Figura S2).Barra minn hekk, l-impatt ta 'sostituzzjonijiet konservattivi Arg-to-Lys jew Lys-to-Arg ġie evalwat f'żewġ każijiet.Bħala kontroll (negattiv), ir-residwi li mhumiex jew anqas ikkonservati fid-dominju NiRAN tal-koronavirus u viruses oħra mnaqqsa huma sostitwiti b'Ala. Sostituzzjoni ta' K4116A (f'motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) u D4280A (CN) inaqqas jew saħansitra jelimina b'mod sinifikanti nsp9 NMPylation permezz nsp12, filwaqt li proteini b'sostituzzjonijiet konservattivi (R4178K), K4116R) iżommu 60% u 80% tal-attività tagħhom, li jindika li r-rilassament tar-restrizzjonijiet fuq in-naħa rispettiva tagħhom ktajjen hija fiżikokimikament sensittiva (Figura 3D).Is-sostituzzjoni ta 'diversi residwi oħra kkonservati E4145A, D4273A, F4281A u D4283A hija ħafna inqas ta' ħsara, u nsp9 UMPylation titnaqqas biss b'mod moderat.Riżultati simili nkisbu f'reazzjonijiet ta 'nsp9 NMPylation li jinvolvu NTPs oħra (Figura 3D u appendiċi SI, Figura S3), li jikkonfermaw li l-effetti osservati fuq sostituzzjonijiet speċifiċi ta' aċidi amminiċi huma indipendenti mit-tip ta 'ko-sottostrat tan-nukleotidi użat.Sussegwentement, ittestjajna l-impatt possibbli ta 'dawn is-sostituzzjonijiet nsp12 fuq ir-replikazzjoni tal-koronavirus fil-kultura taċ-ċelluli.Għal dan il-għan, użajna mudelli xierqa ta' DNA komplementari ta' inġinerija ġenetika (cDNA) kklonati fil-virus vaccinia rikombinanti (23, 24) biex traskrivi 5 -7 ċelluli.It-titrazzjoni tal-proġeni tal-virus infettiv prodott f'dawn iċ-ċelloli wriet li l-biċċa l-kbira tal-mutanti NiRAN HCoV-229E ma kinux fattibbli (Figura 3E).Grupp ta' mutanti virali mhux vijabbli jinkludi alternattivi li ntwerew li jeliminaw jew inaqqsu b'mod sinifikanti l-attività ta' NMP transferase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), iżda hemm żewġ alternattivi oħra (K4116R, E4145A) % riservat?L-attività tagħhom ta 'NMPylation in vitro tissuġġerixxi li restrizzjonijiet addizzjonali huma involuti.Bl-istess mod, żewġ mutazzjonijiet oħra (R4178K, F4281A) li kkawżaw tnaqqis moderat fl-attività ta 'NMPylation in vitro ta' NiRAN ipproduċew viruses ħajjin, madankollu, dawn il-viruses naqqsu b'mod sinifikanti t-titers permezz tar-replikazzjoni.B'mod konsistenti mad-dejta tal-attività in vitro murija fil-Figura 3D, is-sostituzzjoni ta' erba' residwi oħra li mhumiex ikkonservati fil-koronavirus u/jew viruses oħra mnaqqsa (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ipproduċa viruses vijabbli Il-frieħ, minkejja li kellu titer imnaqqas moderatament meta mqabbel mal-virus tat-tip selvaġġ (Figura 3E).
Sabiex jiġi studjat jekk l-attività NMP transferase medjata minn NiRAN tiddependix fuq id-dominju RdRp attiv, iż-żewġ residwi Asp kkonservati involuti fil-koordinazzjoni ta 'joni tal-metall divalenti (11) f'RdRp motif C ġew sostitwiti b'Ala. Il-proteina li tirriżulta nsp12_DD4823/4AA żżomm l-attività tagħha ta' NMPylation nsp9, li tindika li l-attività ta' NMPylation nsp9 in vitro medjata minn nsp12 ma teħtieġx attività tal-polimerażi (Appendiċi SI, Figura S4).
Wara li stabbilixxa l-attività tat-transferase NMP speċifika għal nsp9 għal nsp12, ippruvajna nikkaratterizzaw l-adduct NMP-nsp9 permezz ta 'spettrometrija tal-massa (MS).L-ispettru sħiħ tal-massa tal-proteina ta 'HCoV-229E nsp9 rikombinanti wera quċċata f'12,045 Da (Figura 4A).Iż-żieda ta 'nsp12 ma bidlitx il-kwalità ta' nsp9, u tindika li nsp12 u nsp9 ma jiffurmawx kumpless stabbli taħt il-kundizzjonijiet użati (denaturazzjoni) (Figura 4A).Fil-preżenza ta 'UTP u GTP, il-kejl tal-massa tar-reazzjoni li fiha nsp9 u nsp12 rispettivament wera li l-massa tal-proteina ta' UTP mċaqalqa 306 Da, u l-massa tal-proteina ta 'GTP mċaqalqa 345 Da, li jindika li kull molekula nsp9 torbot UMP jew GMP (Stampa 4) C u D).Huwa spekulat li l-enerġija meħtieġa għal nsp9 NMPylation medjata minn NiRAN ġejja minn idroliżi NTP u rilaxx ta 'pirofosfat.Għalkemm f'din ir-reazzjoni ntużat eċċess molar ta' 10 darbiet ta' nsp9 (mira) minn nsp12 (enzima), ġiet osservata NMPylation kważi kompleta ta' nsp9, li tindika li l-interazzjoni bejn nsp12 u nsp9 hija ta' ħajja qasira, u nsp12 jista' NMPylate aktar nsp9 molekula in vitro.
NMPylation Uniku ta 'nsp9 fil-preżenza ta' nsp12 u UTP jew GTP.Jintwera l-ispettru tal-massa tal-proteina kompluta dekonvoluta ta' HCoV-229E nsp9 (appendiċi SI, Tabella S1) (AD).(A) nsp9 waħdu, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 fil-preżenza ta 'UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 fil-preżenza ta' GTP.
Biex jiġu ddeterminati r-residwi nsp9 UMPylated minn nsp12, nsp9-UMP kien imqassam bi trypsin.Il-peptidi li rriżultaw ġew separati permezz ta 'kromatografija likwida nano-għolja (HPLC) u analizzati permezz ta' spettrometrija tal-massa tandem (MS/MS) onlajn.L-analiżi tad-dejta bl-użu tal-pakkett tas-softwer Byonic (Metriċi tal-Protein) uriet UMPylation tal-aċidu amminiku N-terminal.Dan huwa kkonfermat manwalment.L-ispettru tal-massa tandem tal-peptide prekursur [UMP]NNEIMPGK (appendiċi SI, Figura S5A) wera framment f'421 m/z, li jindika li l-UMP jeħel mal-fdal 1 ta 'nsp9.
Fl-N-terminal ta 'nsp9, Asn huwa kkonservat fost il-membri ta' Orthocoronavirinae (appendiċi SI, Figura S6).Għalkemm nemmnu li n-nitroġenu ta 'l-amina primarja N-terminal huwa l-aktar aċċettatur probabbli għall-UMP, iddeċidejna li niksbu evidenza addizzjonali ta' rbit ta 'NMP fl-N-terminal.Għal din ir-raġuni, il-peptide N-terminal mhux NMPylated u NMPylated nsp9 purifikat mill-HPLC ġie derivat fil-preżenza ta 'aċetun u sodium cyanoborohydride.Taħt dawn il-kundizzjonijiet, amini primarji ħielsa biss jistgħu jiġu modifikati bi propyl (25).Il-peptide derivat minn N-terminal nsp9 bis-sekwenza NNEIMPGK fih żewġ amini primarji, waħda fit-tmiem N ta 'Asn u l-oħra fil-katina tal-ġenb ta' Lys fit-terminal C.Għalhekk, gruppi propil jistgħu jiġu introdotti fiż-żewġt itruf.Il-kromatogrammi tal-joni estratti ta' peptidi mhux NMPylated huma murija fl-appendiċi SI, Figura S5B.Kif mistenni, N-terminal u C-terminal (mono)propylated (SI appendiċi, Figura S5B, korsija ta 'fuq) u peptidi dipropylated (SI appendiċi, Figura S5B, korsija t'isfel) jistgħu jiġu identifikati.Dan il-mudell jinbidel bl-użu tal-peptide NMPylated N-terminal ta 'nsp9.F'dan il-każ, peptidi propilati C-terminal biss jistgħu jiġu identifikati, iżda peptidi propilati N-terminal u peptidi dipropylated mhumiex identifikati (Appendiċi SI, Figura S5C), li jindika li UMP ġie trasferit għall-amina primarja N-terminal Biex jiġi evitat dan grupp milli jagħmel bidliet.
Sussegwentement, nissostitwixxu (b'Ala jew Ser) jew inħassru r-residwi kkonservati fl-N-terminal ta 'nsp9 biex niddefinixxu restrizzjonijiet speċifiċi għall-mira.Ibbażat fuq id-dejta tal-MS tagħna li turi li NiRAN jifforma adduct nsp9-NMP bl-amina primarja tar-residwu N-terminal ta 'nsp9, ipotizzajna li nsp9 NMPylation teħtieġ li l-protease master virali (Mpro, nsp5) tirrilaxxa l-nsp9 N-terminal minn il-prekursur tal-poliproteina tiegħu.Biex nittestjaw din l-ipoteżi, ipproduċejna proteina prekursur nsp7-11 li fiha nsp9 f'E. coli u wettaqna test standard ta 'NMPylation fil-preżenza ta' [α-32P] UTP (materjali u metodi).Kif muri fil-Figura 5A (korsija 3), il-prekursur nsp7-11 mhux maqtugħ mhuwiex radjutikkettat b'nsp12.B'kuntrast, jekk nsp7-11 jinqasam minn nsp5 rikombinanti biex jirrilaxxa nsp9 (u nsps oħra) mill-prekursur, tiġi skoperta proteina radjutikkettata li temigra ma' nsp9, li tikkonferma l-konklużjoni tagħna li NiRAN u N- Formazzjoni selettiva ta' adducts nsp9-NMP kovalenti .L-amina primarja terminali tal-Asn N-terminal (pożizzjoni 3825 f'pp1a/pp1ab).Din il-konklużjoni hija appoġġjata wkoll minn esperimenti li jużaw il-kostrutt nsp9, li fih residwi addizzjonali wieħed jew tnejn fl-N-terminal.Fiż-żewġ każijiet, UMPylation medjat minn NiRAN ta 'nsp9 ġiet abolita (Appendiċi SI, Figura S7).Sussegwentement, ipproduċejna proteina b'residwi Asn wieħed jew tnejn imħassra mis-sekwenza tal-peptide 3825-NNEIMPK-3832 fit-terminal N ta 'nsp9.Fiż-żewġ każijiet, nsp9 UMPylation kienet kompletament imblukkata (Figura 5B), li pprovdiet evidenza addizzjonali li l-nsp9 N-terminus reali jaġixxi bħala riċettur NMP.
L-ipproċessar proteolitiku ta 'nsp9 u r-rwol ta' residwi N-terminali f'UMPylation medjat minn nsp12.(A) nsp9 UMPylation teħtieġ N-terminal nsp9 ħieles.Nsp7-11-His6 huwa pre-inkubat f'temperatura ta '30 °C f'buffer ta' detezzjoni ta 'NMPylation li fih UTP fil-preżenza jew in-nuqqas ta' Mpro rikombinanti (nsp5-His6).Wara 3 sigħat, ibda l-assaġġ NMPylation billi żżid nsp12-His6 kif deskritt f'Materjali u Metodi.Ir-reazzjoni li fiha nsp5-His6 (korsija 1) u nsp9-His6 (korsija 2) intużat bħala kontroll.Wara 10 minuti, ir-reazzjoni ġiet mitmuma u t-taħlita ta 'reazzjoni ġiet isseparata b'SDS-PAGE.Il-proteina kienet imtebba 'b'Coomassie Brilliant Blue (A, fuq).Il-prekursur Nsp7-11-His6 u l-prodott ipproċessat li jirriżulta minn qsim medjat minn nsp5-His6 huma murija fuq il-lemin.Jekk jogħġbok innota (minħabba d-daqs żgħir tagħhom) li nsp7 u nsp11-His6 ma jinstabux f'dan il-ġel, u r-reazzjoni hija supplimentata b'nsp5-His6 (korsiji 1 u 4; il-pożizzjoni ta 'nsp5-His6 hija indikata b'ċirku solidu) jew nsp9-His6 (Lane 2) fih ammont żgħir ta 'MBP (indikat minn ċrieki miftuħa) bħala impuritajiet residwi minħabba li huma espressi bħala proteini ta' fużjoni MBP (appendiċi SI, Tabella S1).(B) Il-varjant Nsp9-His6 m'għandux residwi Asn N-terminal wieħed jew tnejn (numerazzjoni tar-residwi skont il-pożizzjoni f'pp1a/pp1ab) u huwa purifikat u inkubat b'nsp12-His6 u [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE mtebbgħin b'Coomassie jidher fil-parti ta 'fuq, B, l-awtoradjografu korrispondenti jidher fil-qiegħ.Il-pożizzjoni tal-markatur tal-piż molekulari (f'kilodaltons) tidher fuq ix-xellug.(C) residwi kkonservati N-terminal HCoV-229E nsp9-His6 ġew sostitwiti b'Ala jew Ser, u l-istess ammont ta 'proteina intuża fir-reazzjoni ta' UMPylation medjata minn nsp12-His6.Il-prodotti ta 'reazzjoni ġew separati minn SDS-PAGE u mtebbgħin b'Coomassie Brilliant Blue (C, fuq), u nsp9-His6 radjutikkettat ġie skopert permezz ta' immaġini ta 'fosforescenza (C, nofs).Bl-użu ta 'proteina tat-tip selvaġġ (wt) bħala referenza (settjat għal 100%), l-attività relattiva ta' NMPylation (medja ± SEM) ġiet ikkalkulata minn tliet esperimenti indipendenti.(D) It-titri tal-virus fis-supernatant tal-kultura taċ-ċelluli p1 taċ-ċelluli Huh-7 infettati b'ċelluli Huh-7 tat-tip selvaġġ HCoV-229E, u mutanti li jġorru sostituzzjonijiet ta 'amino acids nominati f'nsp9 ġew determinati b'assaġġ tal-plakka.Il-mutant doppju DD4823/4AA ta' RdRp motif C defiċjenti ta' replikazzjoni intuża bħala kontroll negattiv.
It-terminu N ta 'nsp9 (speċjalment il-pożizzjonijiet 1, 2, 3, u 6) huwa kkonservat ħafna fost il-membri tas-sottofamilja Orthocoronavirinae (appendiċi SI, Figura S6).Sabiex jiġi studjat ir-rwol possibbli ta 'dawn ir-residwi fl-NMPylation nsp9 medjat minn nsp12, żewġ residwi Asn konsekuttivi fl-N-terminal ta' nsp9 ġew sostitwiti b'Ala jew Ser (waħdu jew flimkien).Meta mqabbel ma 'nsp9 tat-tip selvaġġ, is-sostituzzjoni ta' N3825 b'Ala jew Ser irriżulta f'aktar minn tnaqqis doppju fl-UMPylation medjat minn nsp12 (Figura 5C).B'konsistenza mal-konklużjoni tagħna li NMPylation isseħħ fl-amina primarja N-terminal minflok il-katina tal-ġenb tar-residwu N-terminal, osservajna NMPylation residwu sinifikanti bis-sostituzzjoni ta 'N3825A u N3825S.Interessanti, jekk it-tieni Asn jiġi sostitwit minn Ala jew Ser, nsp9 UMPylation titnaqqas b'mod aktar qawwi (aktar minn 10 darbiet), filwaqt li s-sostituzzjoni ta 'Ala fil-pożizzjonijiet 3, 4, u 6 għandha biss effett moderat fuq nsp9 UMPylation (Figura 2). ).5C).Riżultati simili nkisbu bl-użu ta' ATP, CTP jew GTP (appendiċi SI, Figura S8).B'mod kollettiv, din id-dejta tindika r-rwol ewlieni ta 'N2826 (pożizzjoni 2 f'nsp9) f'nsp9 NMPylation.
Sabiex tinkiseb evidenza addizzjonali tal-korrelazzjoni funzjonali bejn l-N-terminal ta 'nsp9 u NMPylation, wettaqna allinjament ta' sekwenza multipla (MSA) tas-sekwenza nsp9 tal-familja Coronavirus (li tvarja bejn 104 u 113 residwi) (SI Appendiċi, Figura S6).B'kollox, f'47 speċi (magħrufa u putattivi) ta' 5 ġeneri tas-sottofamilja Orthocoronavirinae li jinfettaw mammiferi, għasafar u ospitanti tar-rettili differenti, 8 residwi biss b'kollox instabu li kienu invarjabbli.L-aktar bidliet estensivi, inklużi tħassir u inserzjonijiet, ġew osservati fiċ-ċikli bejn l-elementi tal-istruttura sekondarja ta 'nsp9, kif determinat minn studji strutturali preċedenti (26 ??28).Instabu ħames residwi invarjanti fil-linja β u l-helix α tal-parti C-terminal ta 'nsp9.Tliet residwi invarjanti jikkostitwixxu l-motif NNE tat-terminal N ta 'nsp9.Huwa żvelat li t-tieni Asn ta 'dan il-motif huwa l-uniku residwu invarjanti, li huwa wkoll kondiviż mill-nsp9 ipotetiku tal-koronavirus taż-żrinġijiet relatat mill-bogħod, u jirrappreżenta l-ispeċi Microhyla letovirus 1 fis-sottofamilja Letovirinae ta' Alphaletovirus.Il-konservazzjoni tar-residwi f'elementi ta 'struttura sekondarja nsp9 tista' tiġi razzjonalizzata minn kunsiderazzjonijiet strutturali biex jinżammu proprjetajiet li jorbtu RNA li jintwew jew magħrufa.Madankollu, dan ir-raġunament ma jidhirx li japplika għall-konservazzjoni ta 'NNE, u qabel dan l-istudju, in-natura tar-restrizzjonijiet li jillimitaw il-varjazzjoni tas-sekwenza tripeptide kienet kompletament mgħottija.
Sabiex tiddetermina l-importanza tal-nsp9-NMPylation u l-konservazzjoni NNE fir-replikazzjoni tal-koronavirus, ipproduċejna mutanti HCoV-229E, li jġorru sostituzzjonijiet singoli jew doppji ta 'residwi nsp9 N-terminal, li jindikaw li nsp9 NMPylation hija ta' ħsara in vitro.Qabel ma nibdew, nippruvaw inwieġbu l-mistoqsija jekk dawn is-sostituzzjonijiet (ħdejn is-sit tal-qsim nsp8|9) jaffettwawx l-ipproċessar proteolitiku tar-reġjun C-terminal pp1a.Sett ta 'nsp7-11 polyprotein constructs li fihom sostituzzjonijiet korrispondenti fl-N-terminal ta' nsp9 ġew prodotti f'E. coli u maqtugħin b'Mpro rikombinanti.Il-qsim proteolitiku tal-erba 'siti (inkluż is-sit tal-ġenb nsp9) mhuwiex affettwat b'mod sinifikanti minn xi sostituzzjonijiet introdotti (appendiċi SI, Figura S9), esklużi bidliet strutturali f'dawn il-proteini li jinterferixxu mal-qsim nsp8 | 9 medjat minn Mpro ( Jew ieħor) websajt.
Iċ-ċelluli Huh-7 ġew trasfettati b'RNA HCoV-229E ta 'tul tal-ġenoma, li jikkodifikaw sostituzzjonijiet Ala jew Ser fit-tripeptidi NNE kkonservati (N3825, N3826, u E3827) fit-terminal Nsp9, li juri li ħafna mill-mutazzjonijiet huma fatali.Stajna nsalvaw il-virus billi nibdlu s-Ser jew l-Ala ta' l-Asn N-terminal (N2835A jew N2835S), iżda naqsu milli nirkupraw il-virus b'mutazzjonijiet singoli u doppji oħra fis-sekwenza NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Figura 5D).
Dawn ir-riżultati jindikaw li r-replikazzjoni tal-koronavirus fil-kultura tat-tessuti hija ristretta (l-istess jew simili), li tillimita l-mutazzjoni naturali tas-siti ta 'nsp9 NMPylation fil-ġisem, u tappoġġja r-rwol ewlieni ta' dan ir-rispons fiċ-ċiklu tal-ħajja tal-koronavirus.
Fl-aħħar sett ta 'esperimenti, ipproduċejna C-terminal His6 ittikkettat SARS-CoV-2 nsp12 u nsp9, u żewġ forom mutanti ta' nsp12 f'E. coli.Ir-residwi tas-sit attiv fid-dominji NiRAN u RdRp kienu rispettivament Uża Ala minflok (Figura 6A u appendiċi SI, Tabella S2).K4465 f'SARS-CoV-2 nsp12 jikkorrispondi għal K4135 f'HCoV-229E (Appendiċi SI, Figura S2), li wera li kien meħtieġ għall-attività NiRAN u r-replikazzjoni tal-HCoV-229E (Figura 3D u E).Dan ir-residwu jikkorrispondi wkoll għar-residwu tal-virus arterjali EAV nsp9 K94, li qabel kien muri li huwa meħtieġ għal NiRAN awto-UMPylation/self-GMPylation (16).Kif muri fil-Figura 6B, SARS-CoV-2 nsp12 għandu attività transferase UMP li juża nsp9 bħala sottostrat, filwaqt li l-mutant tas-sit attiv nsp12_K4465A huwa inattiv.Is-sostituzzjoni doppja fis-sekwenza karatteristika SDD ta 'RdRp motif C ma taffettwax l-attività ta' transferase UMP (Figura 6B), li tindika li l-attività RdRp m'għandha l-ebda effett dirett fl-UMPylation nsp9.Data simili nkisbet bl-użu ta' CTP, GTP u ATP (appendiċi SI, Figura S10).Fil-qosor, din id-dejta tindika li nsp9 NMPylation medjat minn NiRAN għandu attività konservattiva fil-koronavirus li jirrappreżentaw ġeneri differenti tas-sottofamilja tal-orthocoronavirus.
NMPylation ta 'nsp9 medjat minn SARS-CoV-2 nsp12.(A) Ġell SDS-polyacrylamide imtebba 'Coomassie li juri l-proteina rikombinanti użata fit-test ta' NMPylation.Bħala kontroll, intużat proteina mutanti b'sostituzzjoni ta 'sit attiv fid-dominju NiRAN (K4465A) u RdRp (DD5152/3AA) ta' SARS-CoV-2 nsp12.In-numerazzjoni tar-residwi hija bbażata fuq il-pożizzjoni f'pp1ab.(B) Awtoradjografu ta 'skoperta ta' UMPylation bl-użu ta 'nsp9-His6 u [α-32P]UTP bħala s-sottostrat ta' nsp12-His6 (tip selvaġġ [wt] u mutant).Il-massa molekulari (f'kilodaltons) tal-proteina ttikkettjata tidher fuq ix-xellug.
Dominji NiRAN huma ġeneralment konservati f'Nidovirales (16), li jindika li jikkatalizzaw reazzjonijiet enżimatiċi essenzjali għar-replikazzjoni ta' Nidovirus.F'dan l-istudju, stajna nippruvaw li d-dominju NiRAN tal-koronavirus jittrasferixxi NMP (iġġenerat minn NTP) għal nsp9, proteina misterjuża li torbot l-RNA involuta fir-replikazzjoni tal-virus (26 ?? 29 ), biex tiddeterminaha bħala mira naturali u sieħeb tal-coronavirus RTC.
Id-dominju NiRAN jaqsam tliet motivi ta 'sekwenza (AN, BN, u CN), li fihom numru żgħir ħafna ta' residwi li huma kkonservati fil-familji kollha fl-ordni Nidovirales monophyletic iżda differenzjat ħafna (8, 16) .Studji reċenti wrew li huma strutturalment relatati ma 'familja fil-biċċa l-kbira mhux ikkaratterizzata ta' proteini simili ta 'proteina kinażi, li oriġinarjament kienu jissejħu l-familja SelO (17, 19, 22, 30, 31).Proteini relatati mas-SelO għandhom jingħalaq tal-kinase, iżda m'għandhomx diversi residwi ta' sit attiv ikkonservat f'kinażi klassiċi (22, 32).Ibbażat fuq l-orjentazzjoni inversa tal-molekuli ATP marbuta mas-sit attiv u stabbilizzat minn interazzjonijiet speċifiċi, SelO ġie ipotetizzat u sussegwentement ikkonfermat li jittrasferixxi AMP (minflok fosfat) għas-sottostrat tal-proteina (22), filwaqt li proteina batterika oħra simili għal SelO YdiU għandha reċentement intwera li jikkatalizza t-twaħħil kovalenti ta 'UMP ma' residwi Tyr u His ta 'sottostrati ta' proteini differenti (33).
Sabiex nikkonfermaw u nespandu t-tbassir tar-residwi putattivi tas-sit attiv tad-dominju tal-koronavirus NiRAN, użajna metodi bijokimiċi u ġenetika inversa biex inwettqu analiżi tal-mutazzjoni fuq il-koronavirus nsp12 (Figura 3D u E u appendiċi SI, Figura S3 u tabella) S1â S4).Id-dejta turi li s-sostituzzjoni ta’ HCoV-229E K4135, R4178 u D4280 b’Ala telimina l-attività ta’ NMP transferase in vitro u r-replikazzjoni tal-virus fil-kultura taċ-ċelluli (Figura 3D u E u appendiċi SI, Figura S3), li tappoġġja l-preżenza tagħhom f’NTP γ-fosfat (K4135, R4178) u l-koordinazzjoni tal-joni tal-metall tas-sit attiv (D4280).Is-sostituzzjoni E4145A tal-Glu konservat fil-medda tal-virus tal-bejta tal-għasafar imbassar li jistabbilizza l-pożizzjoni K4135 (17) intwera li telimina r-replikazzjoni virali, iżda b'mod sorprendenti, l-attività nżammet fl-assaġġ NMPylation in vitro (Figura 3D u E u appendiċi SI, Figura S3 U Tabelli S1–S4).Osservazzjoni simili saret meta s-sostituzzjoni korrispondenti ġiet introdotta fl-omologu YdiU tas-Salmonella typhimurium (E130A) (33).Meħuda flimkien, din id-dejta tappoġġja l-funzjoni regolatorja ta 'dan ir-residwu kkonservat aktar milli l-funzjoni katalitika.
Is-sostituzzjoni tar-residwu Phe konservat (F4281A) fil-medda ta 'nestovirus fid-dominju NiRAN HCoV-229E (8) irriżulta fi tnaqqis fl-attività ta' NMPylation in vitro u tnaqqis sinifikanti fir-replikazzjoni tal-virus fil-kultura taċ-ċelluli (Figura 3D, E u SI) appendiċi, Figura S3).Id-dejta hija konsistenti mal-funzjoni regolatorja importanti ta 'dan ir-residwu, bħar-residwu omologu DFG motif Phe muri qabel.Fil-kinases tal-proteini klassiċi, hija parti mill-linja li torbot Mg2 + u tgħin biex tiġbor u tirregola s-sinsla???Meħtieġa għal attività katalitika effettiva (32, 34).Is-sostituzzjoni ta' Ala u Arg għal residwi K4116 (fil-motiv preAN), rispettivament, eliminat ir-replikazzjoni virali u, kif mistenni, kellha effetti differenti fuq l-attività tat-transferase NMP in vitro, skont il-katina tal-ġenb tal-aċidu amminiku introdotta (Figura 3D U E u appendiċi SI , Figura S3).Id-dejta funzjonali hija konsistenti mal-informazzjoni strutturali, li tindika li dan ir-residwu stabbilixxa interazzjoni mal-fosfat ATP (17).Fid-dominju NiRAN ta 'familji ta' virus ibestjati oħra, il-pożizzjoni ta 'HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 hija okkupata minn Lys, Arg jew His (8), li jindika li r-restrizzjoni funzjonali ta' dan ir-residwu speċifiku ġiet rilassata.Is-sostituzzjoni ta 'D4188A u D4283A telimina jew tnaqqas bil-qawwa l-attività ta' l-enżimi u telimina r-replikazzjoni tal-virus (Figura 3).Dawn iż-żewġ residwi huma kkonservati fil-biċċa l-kbira (iżda mhux kollha) tal-viruses imdaħħla (8), li jindikaw funzjoni importanti speċifika għall-familja iżda possibbilment mhux katalitika.Sostituzzjonijiet Ala ta 'diversi residwi oħra Lys u Asp (K4113A, D4180A, D4197A u D4273A) li mhumiex konservati fil-Coronaviridae jew familji oħra Nestioviridae (8) intużaw bħala kontrolli.Kif mistenni, dawn is-sostituzzjonijiet huma fil-biċċa l-kbira tollerabbli, bi tnaqqis żgħir fl-attività tal-enzimi u r-replikazzjoni virali f'xi każijiet (Figura 3 u appendiċi SI, Figura S3).B'mod ġenerali, id-dejta tal-mutaġenesi tal-koronavirus hija konsistenti ħafna mad-dejta tal-awto-GMP u tal-ġenetika inversa tal-EAV NiRAN-RdRp (16), li fiha EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residwu K94 (li jikkorrispondi għal HCoV- 229E K4135) funzjonijiet importanti), R124 (li jikkorrispondi għal R4178), D132 (li jikkorrispondi għal D4188), D165 (li jikkorrispondi għal D4280), F166 (li jikkorrispondi għal F4281).Barra minn hekk, id-dejta dwar il-mutaġenesi tal-HCoV-229E hija konsistenti ma’ u estiża mid-dejta tal-ġenetika inversa tas-SARS-CoV irrappurtata qabel (16), daqstant ieħor simili ħafna għal dawk osservati għall-mutant korrispondenti CN Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12 Il- fenotip deskritt -F219A u HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D u E u appendiċi SI, Figura S3 u Tabella S1-S4).
Meta mqabbel ma 'orthologs EAV (16), li għandhom preferenza ċara għal UTP u GTP (fir-reazzjoni ta' awto-NMPylation), l-istudju tagħna juri li d-dominju tal-koronavirus NiRAN (rappreżentat minn HCoV-229E u SARS-CoV-2) jista 'jkun effettiv. trasferiti L-erba 'NMPs kollha, għalkemm hemm preferenza żgħira għall-UMP (Figuri 1 u 3).L-ispeċifiċità relattivament baxxa tal-ko-sottostrat speċifiku tal-NTP hija konsistenti mal-istruttura superkomposita SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 irrappurtata reċentement, li fiha ADP-Mg2+ jeħel mas-sit attiv ta 'NiRAN, iżda mhux mal-Parti tal-adenina tal-formazzjoni ta' interazzjonijiet speċifiċi (17).Fl-istudju tagħna, it-tip ta 'nukleotide użat fir-reazzjoni NMPylation m'għandu l-ebda effett differenzjali fuq l-attività tal-proteina mutanti (SI Appendiċi, Figura S3), li jindika li l-ebda wieħed minn dawn ir-residwi ma huwa relatat mill-qrib mal-irbit ta' nukleobase speċifika.Il-bażi strutturali u s-sinifikat bijoloġiku potenzjali tal-preferenzi differenti tal-ko-sottostrat NTP osservati fid-dominji NiRAN tal-koronavirus u l-viruses arterjali għad iridu jiġu studjati;jistgħu jkunu veri jew jistgħu jkunu minħabba l-limitazzjonijiet tal-istudji rispettivi tagħhom.Fil-preżent, ma jistax jiġi eskluż li l-attività potenzjali NMPylator tad-dominju NiRAN tal-virus arterjali (meta mqabbel mal-attività ta’ awto-NMPylation ikkaratterizzata qabel) għandha preferenza ta’ ko-sottostrat differenti, b’kont meħud li x-xebh bejn l-arterjali u l-koronavirus Id-dominju NiRAN jinsab fil-limitu tiegħu.Qabbel ibbażat fuq is-sekwenza (16).Meta mqabbel mal-psewdokinase SelO, li juża Mg2 + bħala kofattur, l-attività tal-koronavirus u l-virus arterjali NiRAN hija dipendenti fuq Mn2 + (16) (Figura 3C u appendiċi SI, Figura S1).Id-dipendenza fuq Mn2+ u l-preferenza ovvja għall-UTP hija karatteristika mhux tas-soltu tal-proteina NMPylators, u reċentement ġiet ikkonfermata biss fil-proteina YdiU tas-Salmonella typhimurium, li tikkatalizza l-UMPylation stretta tal-proteina dipendenti fuq Mn2+ biex tipproteġi ċ-ċelloli mill-induzzjoni tal-istress Cell ATP pool ( 33).
Ix-xebh strutturali deskritt reċentement bejn id-dominju tal-koronavirus NiRAN u l-proteini kinases ċellulari (17, 19) jipprovdi appoġġ addizzjonali għall-kapaċità ta 'NiRAN li jgħaqqad b'mod kovalenti NMP ma' proteini oħra li rrapportajna f'dan l-istudju.Aħna ffukaw it-tfittxija tagħna għal miri NiRAN possibbli fuq il-proteini kodifikati minn HCoV-229E ORF1a, li huma magħrufa li jassistu direttament jew indirettament ir-replikase kodifikata bl-ORF1b tal-RTC (12, 35).L-esperimenti tagħna jipprovdu evidenza konklużiva għall-NMPylation effettiva u speċifika ta 'nsp9 (Figura 2).Jekk il-proteina fil-mira tintuża f'eċċess molari li huwa 8 sa 10 darbiet ogħla minn dak tal-enzima (nsp12), huwa kkonfermat li nsp9 huwa kompletament (mono)NMPizzat (Figura 4).Aħna kkonkludejna li l-interazzjoni bejn nsp12 u nsp9 hija ta 'ħajja qasira u mhux se tifforma kumpless stabbli ma' nsp9 (fin-nuqqas ta 'subunitajiet RTC oħra).Din il-konklużjoni hija appoġġjata minn studji dwar l-interazzjoni tal-proteini fuq il-proteoma SARS-CoV (35).L-analiżi MS identifikat l-amina primarja tar-residwu N-terminal ta 'nsp9 bħala s-sit ta' NMPylation (appendiċi SI, Figura S5).Il-formazzjoni tar-rabta phosphoramidate u l-grupp amino N-terminal tiddistingwi l-attività ta 'NMPylation medjata minn NiRAN mir-reazzjoni ta' AMPylation medjata minn SelO ta 'Pseudomonas syringae, li tikkatalizza l-formazzjoni ta' AMP marbut ma 'O f'Ser, Thr, jew residwi Tyr Peptide adduct ( 22), u S. typhimurium YdiU jifforma adducts peptide-UMP O-linked (b'Tyr) u N-linked (b'His).L-informazzjoni limitata disponibbli fuq il-familja ta 'proteini SelO tindika li l-membri ta' din il-familja kbira ta 'proteini jvarjaw ħafna fil-formazzjoni ta' adducts peptide-NMP.Din hija osservazzjoni interessanti li jistħoqqilha aktar studju.
Id-dejta miksuba f'dan l-istudju wasslitna biex nissuponu li l-NMPylation ta 'nsp9 teħtieġ N-terminus ħieles.Fil-kuntest tar-replikazzjoni virali, dan se jiġi pprovdut mill-qsim proteolitiku tas-sit tal-ipproċessar nsp8|nsp9 fir-replikase polyprotein pp1a medjata minn Mpro u pp1ab.Fil-biċċa l-kbira tal-koronavirus, id-differenza bejn dan is-sit speċifiku (VKLQ|NNEI f'HCoV-229E) u s-siti l-oħra kollha tal-qsim tal-koronavirus Mpro hija Asn (minflok residwu żgħir ieħor, bħal Ala, Ser Or Gly) jokkupa P1â???Post (36).Id-dejta tal-qsim tal-peptidi miksuba fl-istudji bikrija wriet li l-effiċjenza tal-qsim tas-sit nsp8|nsp9 kienet aktar baxxa minn dik ta 'siti oħra, u tindika li 1) dan is-sit speċifiku jista' jkollu rwol regolatorju fl-ipproċessar koordinat f'waqtu tas-C-terminal reġjun pp1a, jew 2) a Ir-rwol tal-nsp9 N-terminus speċjali kkonservat fir-replikazzjoni tal-virus (37).Id-dejta tagħna (Figura 5A) wriet li l-forma rikombinanti ta 'nsp9 li ġġorr is-sekwenza N-terminal reali kienet effettivament NMPized minn nsp12.Is-sekwenza tal-ġenb N-terminal tneħħiet b'fattur Xa (nsp9-His6; appendiċi SI, Tabella S1) jew qsim medjat minn Mpro (nsp7-11-His6; Figura 5A u appendiċi SI, Tabella S1).Importanti, il-prekursur mhux maqtugħ li fih nsp9 nsp7-11-His6 wera reżistenza għal NMPylation ta 'nsp12, li hija konsistenti mad-dejta tagħna, li tindika li l-adduct nsp9-NMP huwa ffurmat permezz tal-amina primarja N-terminal ( appendiċi SI, Figura S5) .Biex niksbu għarfien aktar profond tal-ispeċifiċità tas-sottostrat NiRAN, imbagħad iffukajna fuq ir-residwi N-terminali ta 'nsp9 adjaċenti.Fin-nuqqas ta 'proteini oħra, huma strutturalment flessibbli, li jipprevjenuhom milli jiġu skoperti fil-forma mhux ittikkettata ta' nsp9 (26 28, 38), li jindika l-varjazzjoni naturali limitata tagħhom Dan huwa dovut għas-sekwenza importanti speċifika (mhux relatata ma 'struttura sekondarja) funzjoni tal-framment N-terminal nsp9.Is-sostituzzjonijiet Ala ta 'residwi kkonservati f'dan ir-reġjun (Figuri 5C u D u appendiċi SI, Figura S8) jiżvelaw li N3826 huwa essenzjali għal nsp9 NMPylation in vitro, filwaqt li s-sostituzzjonijiet N3825A u E3827A jwasslu għal tnaqqis fl-NMPylation, filwaqt li s-sostituzzjonijiet M3829A u P3830A ma jagħmlux dan. .Ovvjament jaffettwa nsp9 NMPylation.Għalkemm is-sostituzzjoni ta 'N-terminal Asn (N3825A, N3825S) għandha biss effett moderat fuq nsp9 NMPylation u replikazzjoni tal-virus fil-kultura taċ-ċelluli (Figura 5C u D), it-tħassir ta' sekwenza ta 'residwu Asn mid-dipeptide N-terminal 3825-NN ppruvat li jkun Huwa letali għall-viruses, li jindika li residwu wieħed Asn huwa meħtieġ qabel residwu ieħor fl-N-terminal, preferibbilment Asn, għalkemm jidher li s-sostituzzjoni ta 'residwi simili tista' tiġi parzjalment tollerata (Figura 5B, C, u D).Aħna nikkonkludu li d-dipeptide 3825-NN, speċjalment ir-residwu N3826 kkonservat u essenzjali fil-medda tal-koronavirus (appendiċi SI, Figura S6), jiżgura l-irbit u l-orjentazzjoni korretti tal-nsp9 N-terminus fis-sit attiv ta 'NiRAN.
Is-sostituzzjoni ta' Ala (E3827A) għall-Glu kkonservat tas-sottofamilji kollha żżomm nsp9 NMPylation in vitro iżda hija letali għall-viruses fil-kultura taċ-ċelluli (Figura 5C u D), li tindika l-funzjoni addizzjonali ta 'dan ir-residwu, pereżempju, f'interazzjonijiet ewlenin (NMPylated jew mhux modifikat). ) nsp9 N-terminus u fatturi oħra involuti fir-replikazzjoni tal-virus.Mutazzjonijiet Nsp9 ma affettwawx il-proċess proteolitiku ta 'nsp9 jew kwalunkwe nsps adjaċenti (39) (SI Appendiċi, Figura S9), li jindika li l-fenotipi letali ta' diversi mutazzjonijiet nsp9 osservati ma kinux ikkawżati mid-disregolazzjoni taż-żona pp1a terminali tal-proċess proteolitiku C. .
Id-dejta ta 'hawn fuq tipprovdi evidenza li wara t-trattament medjat minn Mpro tas-sit tal-qsim ta' nsp8 | 9 f'pp1a/pp1ab, l-N-terminal ta 'nsp9 jista' jiġi UMPylated (jew parzjalment modifikat b'NMP ieħor).Barra minn hekk, il-konservazzjoni eċċellenti tal-N-terminus ta 'nsp9 (inklużi r-residwi Asn singulari u invarjanti fil-familja tal-koronavirus) u d-dejta tal-ġenetika inversa miksuba f'dan l-istudju (Figuri 3E u 5D) wassluna biex nikkonkludu li n-nsp9 NMPylation deskritt hija bijoloġikament relatata u essenzjali għar-replikazzjoni tal-koronavirus.Il-konsegwenzi funzjonali ta 'din il-modifika għad iridu jiġu studjati, pereżempju, fir-rigward tal-attività li torbot RNA nsp9 (mhux speċifika) deskritta qabel (forma mhux modifikata) (2628).NMPylation N-terminal jista 'wkoll jaffettwa l-interazzjoni ta' nsp9 ma 'sottostrati ta' proteina jew RNA jew il-formazzjoni ta 'assemblaġġi differenti ta' erba 'livelli.Dawn ġew osservati fi studji strutturali u ġew ikkonfermati li huma funzjonalment relatati mar-replikazzjoni tal-koronavirus, għalkemm speċjalment fin-nuqqas ta ' Fil-każ ta 'din il-modifika (26- âââ29, 40).
Għalkemm l-ispeċifiċità fil-mira tad-dominju NiRAN tal-koronavirus għad trid tiġi kkaratterizzata f'aktar dettall, id-dejta tagħna turi li l-ispeċifiċità fil-mira tal-proteini tad-dominju NiRAN tal-koronavirus hija dejqa ħafna.Għalkemm il-konservazzjoni ta 'residwi tas-sit attivi ewlenin (8, 16) fid-dominju NiRAN tal-familji kollha ta' nidovirus tappoġġja bil-qawwa l-attività tal-NMPylator kkonservat dawn il-proteini, l-identità tar-residwi tal-but li torbot is-sottostrat ta 'dan id-dominju. Konservazzjoni u konservazzjoni għad iridu jiġu kkaratterizzati , u jistgħu jvarjaw bejn familji differenti ta 'għanijiet Nidovirales.Bl-istess mod, il-miri rilevanti ta 'viruses oħra nested għad iridu jiġu determinati.Jistgħu jkunu ortologi remoti ta 'nsp9 jew proteini oħra, minħabba li s-sekwenzi barra l-ħames domains replicase li huma ġeneralment ikkonservati f'viruses nested huma inqas ikkonservati (8), inkluż il-firxa tal-ġenoma bejn Mpro u NiRAN, Fost dawn, nsp9 jinsab fil- koronavirus.
Barra minn hekk, bħalissa ma nistgħux neskludu l-possibbiltà li d-dominju NiRAN ikollu miri addizzjonali (inklużi ċellulari).F'dan il-każ, ta 'min isemmi li l-omologi batterjali f'din il-proteina emerġenti NMPylators (NMPylators) (30, 31) jidhru li għandhom "regolaturi prinċipali"?NMP jimmodula varjetà ta 'proteini ċellulari biex jirregola jew jelimina l-attivitajiet downstream tagħhom, u b'hekk ikollu rwol f'varjetà ta' proċessi bijoloġiċi, bħal rispons għall-istress ċellulari u omeostażi redox (22, 33).
F'dan l-istudju (Figuri 2 u 4 u SI Appendiċi, Figuri S3 u S5), stajna nippruvaw li nsp12 ittrasferixxa l-parti UMP (NMP) għal pożizzjoni waħda (konservata) f'nsp9, filwaqt li proteini oħra ma ġewx modifikati fil- użat Taħt il-kundizzjonijiet, l-ispeċifiċità tas-sottostrat definita sew (aktar milli maħlula) hija appoġġjata.B'mod konsistenti ma 'dan, meta mqabbel ma' NMPylation nsp9 N-terminal, l-attività ta 'NMPylation ta' nsp12 stess hija baxxa ħafna, l-iskoperta tagħha teħtieġ ħin itwal ta 'espożizzjoni awtoradjografika, u tintuża żieda ta' 10 darbiet fil-konċentrazzjoni nsp12.Barra minn hekk, l-analiżi MS tagħna naqset milli tipprovdi evidenza għall-NMPylation ta 'nsp12, li tissuġġerixxi li l-awto-NMPylation tad-dominju NiRAN hija (fl-aħjar) attività sekondarja.Madankollu, għandu jiġi nnutat li studji oħra pprovdew evidenza preliminari li l-istatus ta 'awto-AMPylation ta' NMPylator batterjali jista 'jikkontrolla l-attività ta' NMPylation tagħhom fuq substrati ta 'proteini oħra (22, 33).Għalhekk, hija meħtieġa aktar riċerka biex tinvestiga l-effetti funzjonali possibbli ta 'attivitajiet ta' awto-NMPylation irrappurtati għall-EAV nsp9 (16) u l-koronavirus nsp12 (dan l-istudju), inkluż l-effett propost bħal chaperone fuq it-tiwi tad-dominju C-terminal RdRp ( 16) ).
Preċedentement, ġew ikkunsidrati bosta ipoteżi dwar il-funzjonijiet downstream possibbli tad-dominju NiRAN nidoviral, inklużi RNA ligase, RNA -capped guanylate transferase u proteina priming attività (16), iżda l-ebda waħda minnhom ma hija kompatibbli mal-funzjonijiet downstream disponibbli.L-informazzjoni miksuba fil-pożizzjonijiet li ġejjin hija eżattament l-istess ħin mingħajr ma jsiru suppożizzjonijiet addizzjonali.Id-dejta miksuba f'dan l-istudju hija l-aktar konsistenti ma' (iżda ma tistax tipprova) li d-dominju NiRAN huwa involut fil-bidu tas-sintesi tal-RNA indotta mill-proteini.Qabel kien maħsub li l-funzjoni tad-dominju NiRAN fil-5??²-RNA capping jew RNA ligation reazzjonijiet mhumiex affettwati minn dawn u Appoġġ ta 'dejta oħra.Għalhekk, pereżempju, is-sit attiv ta 'NiRAN huwa kkunsidrat li jinvolvi l-Asp konservat bħala bażi ġenerali (D252 f'Pseudomonas syringae SelO; D4271 f'HCoV-229E pp1ab; D208 f'SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendiċi, figura 2) ).S2) (17, 22, 33), filwaqt li l-katalisi fl-RNA ligase dipendenti fuq ATP u l-enzima tal-capping RNA titwettaq mill-intermedjarju tal-enzima kovalenti-(lysyl-N)-NMP, li tinvolvi residwu Lys mhux Mibdul ( 41).Barra minn hekk, l-ispeċifiċità notevoli bbażata fuq is-sekwenza tal-koronavirus NiRAN għal miri ta 'proteini kkonservati u l-ispeċifiċità rilassata għal ko-sottostrati NTP (jippreferi UTP) jopponi enzima ta' capping medjata minn NiRAN jew funzjonijiet simili għal RNA ligase.
Ovvjament, huwa meħtieġ ħafna xogħol żejjed biex jiġi vverifikat u, jekk ippruvat, jelaborat dwar ir-rwol possibbli ta 'nsp9-UMP (nsp9-NMP) fis-sintesi ta' RNA indotta mill-proteini, li se jgħaqqdu diversi rapporti interessanti iżda (s'issa) irrappurtati qabel. .Osservazzjonijiet iżolati.Pereżempju, ġie determinat li t-tarf tal-RNA negattiv tal-koronavirus jibda b'linja oligo(U) (42, 43).Din l-osservazzjoni hija konsistenti mal-idea li s-sintesi ta’ RNA ta’ fergħa negattiva tinbeda billi torbot il-forma UMPylated ta’ nsp9 mad-denb poly(A) ( triggers), li tista’ tiġi promossa bit-twaħħil tal-RNA tagħha L-attività u/jew l-interazzjoni ma’ proteina RTC oħra.Il-porzjon UMP ipprovdut minn nsp9 jista' mbagħad jintuża bħala "primer" għal oligouridylation medjat minn nsp7/8/nsp12, bl-użu tad-denb 3??²-poly(A) fl-RNA ġenomika jew Sekwenza oħra li fiha oligo (A) iservi bħala mudell, simili għall-mekkaniżmu stabbilit għall-proteina picornavirus VPg (44).X'jiġri jekk il-proposta hija "mhux normattiva"????Il-bidu tas-sinteżi tal-fergħa negattiva (indotta mill-proteini) tipprovdi rabta mal-osservazzjonijiet, li tindika li l-RNA tal-fergħa negattiva tal-koronavirus għandu UMP (minflok UTP) fit-tarf tiegħu (42), li jitqies li jindika li l- aċidu nuklejku Dicer jaqsam it-tarf fosforilat minn endonukleażi speċifika għall-uridina mhux magħrufa.Jekk tkun ikkonfermata, din l-attività idrolitika tal-aċidu nuklejku tista 'tgħin biex tirrilaxxa l-forma oligomerika UMPylated ta' nsp9 mit-tarf 5 ² tal-linja negattiva naxxenti.Ir-rwol possibbli ta 'nsp9 fil-priming tal-proteini huwa wkoll konsistenti ma' studji preċedenti tal-ġenetika inversa, li wrew li nsp9 (u nsp8) jinteraġixxu b'mod kritiku u speċifikament mal-element RNA li jaġixxi cis qrib it-3 tarf tal-ġenoma tal-koronavirus.45).Skont dan ir-rapport, dawn l-osservazzjonijiet preċedenti issa jistgħu jerġgħu jiġu eżaminati u estiżi permezz ta’ aktar riċerka.
Fil-qosor, id-dejta tagħna ddeterminat l-attività speċifika ta 'tikketta proprjetarja tal-enżima tal-virus imnaqqsa marbuta ma' RdRp fl-N-terminal.Fil-koronavirus, din l-attività UMPylator/NMPylator medjata minn NiRAN li għadha kif ġiet skoperta tintuża biex tiddependi fuq Mn2+ u residwi Asn maġenb u tikkawża l-formazzjoni ta’ rabtiet ta’ fosforamidat (b’enerġija baxxa) mal-amina primarja N-terminal.Permezz ta 'qsim medjat minn Mpro fis-sit ta' qsim nsp8|9, il-mira nsp9 tista 'tintuża għal NMPylation, li tindika l-akkoppjar funzjonali bejn il-protease u d-dominju NiRAN, li jestendi għal RdRp.Il-konservazzjoni ta 'residwi ewlenin fis-sit attiv ta' nsp12 NiRAN u l-mira nsp9, flimkien ma 'dejta miksuba minn żewġ koronavirus inkluż SARS-CoV-2, tipprovdi evidenza qawwija li nsp9 NMPylation hija koronavirus Il-karatteristiċi konservattivi huma wkoll pass ewlieni fir-replikazzjoni tal-virus.Id-dejta disponibbli twassalna biex nikkonkludu li r-rwol speċifiku tal-forma NMPylated ta 'nsp9 fis-sintesi ta' RNA indotta mill-proteini huwa xenarju raġonevoli għall-koronavirus u viruses oħra mnaqqsa, u NiRAN jista 'jimmira wkoll proteini oħra mhux identifikati.Irregola l-virus.Interazzjoni ospitanti.Jekk jiġi kkonfermat, l-involviment tal-proteini primers fis-sintesi tal-RNA virali se jżid l-affinità tas-sekwenza tad-dominji Mpro/3CLpro u RdRp bejn il-koronavirus misjuba qabel u s-supergrupp bħal picornavirus (9), li issa ġew unifikati fil-Pisonivirites stabbiliti reċentement ( 46) fil-kategorija.
Id-dejta tagħna turi wkoll li l-attivitajiet tal-enzimi bażiċi, selettivi u konservattivi identifikati f'dan l-istudju jistgħu jintużaw bħala miri għal mediċini antivirali.Il-komposti li jinterferixxu mal-irbit (u l-modifika sussegwenti) tal-konservat nsp9 N-terminus fis-sit attiv ta 'NiRAN jistgħu jiġu żviluppati f'mediċini antivirali effettivi u versatili, adattati għat-trattament ta' koronavirus tal-annimali u umani minn Infezzjonijiet (sotto)ġeneri differenti. , inkluż SARS-CoV-2 u l-Coronavirus tas-Sindrome Respiratorju tal-Lvant Nofsani.
Is-sekwenza ta 'kodifikazzjoni tal-proteina tal-koronavirus prodotta f'dan l-istudju ġiet amplifikata permezz ta' RT-PCR bl-użu ta 'RNA iżolat minn Huh-7 infettat b'HCoV-229E jew Vero E6 infettat b'SARS-CoV-2, u mdaħħla bl-użu ta' proċeduri ta 'klonazzjoni standard.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) jew pASK3-Ub-CHis6 (47) vettur ta' espressjoni (SI Appendiċi, Tabelli S1 u S2).Sostituzzjonijiet ta' kodon wieħed ġew introdotti permezz ta' mutaġenesi diretta fuq is-sit ibbażata fuq PCR (48).Biex tipproduċi l-proteina tal-fużjoni MBP, iċ-ċelluli E. coli TB1 ġew trasformati bil-kostrutt tal-plasmid pMAL-c2 xieraq (appendiċi SI, Tabella S1).Il-proteina tal-fużjoni ġiet ippurifikata permezz ta' kromatografija ta' affinità ta' amylose u maqsuma bil-fattur Xa.Sussegwentement, il-proteina bit-tikketta C-terminal His6 ġiet ippurifikata permezz ta 'kromatografija ta' affinità tal-metall immobilizzata Ni (Ni-IMAC) kif deskritt qabel (49).Biex jipproduċu l-proteina tal-fużjoni ta 'ubiquitin, ċelluli E. coli TB1 użaw il-kostruzzjoni xierqa tal-plasmid pASK3-Ub-CHis6 (Appendiċi SI, Tabelli S1 u S2) u DNA plasmid pCGI li jikkodifika l-idrolażi C-terminal 1 speċifiku għall-ubiquitin (Ubp1).Trasformazzjoni (47).Il-proteina tal-koronavirus bit-tikketta C-terminal His6 ġiet ippurifikata kif deskritt qabel (50).
It-test ta 'awto-NMPylation ta' HCoV-229E nsp12-His6 sar kif deskritt f'EAV nsp9 (16).Fil-qosor, nsp12-His6 (0.5 µM) fih 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer, inkubata l-NTP speċifikat u 0.17 µM mqabbla [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) fi 30 °C għal 30 minuta.Fl-assaġġi l-oħra kollha (standard) ta 'NMPylation ta' nsp9 NMPylation medjat minn nsp12, il-kundizzjonijiet ta 'reazzjoni huma aġġustati kif ġej: nsp12-His6 (0.05 µM) u nsp9-His6 (4 µM) fil-preżenza ta' 50 mM HEPES-KOH (pH 80). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM indikat NTP, u 0.17 µM mqabbla [α32-P]NTP.Wara l-inkubazzjoni għal 10 minuti fi 30°C, il-kampjun tar-reazzjoni tħallat ma' buffer tal-kampjun SDS-PAGE: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol u 0.005% bromophenol blu.Il-proteina ġiet żnaturata billi tissaħħan f'90 °C għal 5 minuti u separata bi 12% SDS-PAGE.Il-ġell jiġi ffissat u mtebba’ b’soluzzjoni Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% aċidu aċetiku, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), dekolorizzat, u espost għal skrin ta’ immaġini fosforexxenti għal 20 siegħa (biex tiskopri nsp12 minn NMPylation) jew (massimu) 2 Sigħat (biex tiġi vvalutata nsp9 NMPylation).Intuża imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) biex tiskennja l-iskrin u ImageJ intuża biex tanalizza l-intensità tas-sinjal.
Għall-analiżi MS, 1 µM nsp12-His6 u 10 µM nsp9 (mingħajr tikketta hexahistidine) intużaw fl-analiżi NMPylation (appendiċi SI, Tabella S1) u ntużaw il-konċentrazzjoni miżjuda ta '500 µM UTP u GTP.Skont il-konċentrazzjoni tagħhom u l-kwalità mistennija tal-proteina, intużat sistema Waters ACQUITY H-Class HPLC mgħammra b'kolonna MassPrep (Waters) biex tneħħi 1 sa 10 µL ta' soluzzjonijiet ta' proteini buffered onlajn.Il-proteina mneħħija mill-melħ tiġi eluduta fis-sors tal-jone elettrospray tal-ispettrometru tal-massa Synapt G2Si (Ilmijiet) permezz tal-gradjent li ġej tal-buffer A (ilma/0.05% aċidu formiku) u buffer B (acetonitrile/0.045% aċidu formiku), u t-temperatura tal-kolonna hija 60 ° C u rata ta 'fluss ta' 0.1 mL/min: elużjoni isokratika b'5% A għal 2 minuti, imbagħad gradjent lineari għal 95% B fi żmien 8 minuti, u żomm 95% B għal 4 minuti oħra.
Jinstabu joni pożittivi b'firxa ta 'massa ta' 500 sa 5000 m/z.Glu-fibrinopeptide B jitkejjel kull 45 sekonda għall-korrezzjoni awtomatika tad-drift tal-massa.Uża softwer tal-istrumenti MassLynx b'estensjoni MaxEnt1 biex tneħħi l-konvoluzzjoni tal-ispettru medju wara li tnaqqas il-linja bażi u twitti.
UMPylated HCoV-229E nsp9 ġie diġerit billi żżid trypsin modifikat ta 'grad ta' sekwenza (Serva) u inkubat matul il-lejl f'37 °C.Kolonna spin Chromabond C18WP (numru tal-parti 730522; Macherey-Nagel) intużat biex tneħħi l-melħ u tikkonċentra l-peptidi.Fl-aħħarnett, il-peptide ġie maħlul f'25 µL ta 'ilma, li kien fih 5% aċetonitrile u 0.1% aċidu formiku.
Il-kampjuni ġew analizzati mill-MS bl-użu ta' spettrometru tal-massa Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Is-sistema aħħarija nanoâ HPLC (Dionex), mgħammra b'50 ċm immuntat fit-tarf tad-dwana?Kolonna C18 RP ta '75 μm ippakkjata b'żibeġ manjetiċi ta' 2.4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Qabbad mal-ispettrometru tal-massa onlajn permezz tas-sors nanospray Proxeon;injetta 6 µL ta' soluzzjoni tad-diġestjoni tat-tripsin f'dijametru intern ta' 300 µm ×??1 ċm C18 PepMap kolonna ta’ qabel il-konċentrazzjoni (Thermo Scientific).Bl-użu ta 'ilma/0.05% aċidu formiku bħala s-solvent, il-kampjun kien awtomatikament maqbud u desalinizzat b'rata ta' fluss ta '6 µL/min.
Il-gradjenti li ġejjin ta 'ilma/0.05% aċidu formiku (solvent A) u 80% aċetonitrile/0.045% aċidu formiku (solvent B) intużaw biex tinkiseb is-separazzjoni ta' peptidi tryptic b'rata ta 'fluss ta' 300 nL/min: 4% B għal 5 minuti, imbagħad 30 A gradjent lineari għal 45% B fi ftit minuti, u żieda lineari għal 95% solvent B fi żmien 5 minuti.Qabbad il-kolonna kromatografika ma 'nano-emitter tal-istainless steel (Proxeon), u roxx l-eluwent direttament mal-kapillari msaħħna tal-ispettrometru tal-massa billi tuża potenzjal ta' 2,300 V. L-iskenn tal-istħarriġ b'riżoluzzjoni ta '60,000 fl-analizzatur tal-massa Orbitrap huwa assoċjat b'mill-inqas tliet skans MS/MS tad-dejta, esklużi dinamikament għal 30 sekonda, bl-użu ta 'dissoċjazzjoni indotta ta' kolliżjoni ta 'nassa lineari jew dissoċjazzjoni ta' kolliżjoni ta 'enerġija ogħla flimkien ma' sejbien ta 'orbitrap, Ir-riżoluzzjoni hija 7,500.
Ħin tal-post: Awissu-03-2021